此後6年間,他撰寫了《關於托勒密和哥白尼兩大世界體係對話》一書，1630年他第5次到羅馬,取得了此書的“出版許可證”。此書終於在1632年出版了。此書在表麵上保持中立，但實際上卻為哥白尼體係辯護，並多處對教皇和主教隱含嘲諷，遠遠超出了僅以數學假設進行討論的範圍。全書筆調詼諧，在意大利文學史上列為文學名著。
教廷的迫害和晚年生活《對話》出版後6個月,羅馬教廷便勒令停止出售，認為作者公然違背“1616年禁令”，問題嚴重，亟待審查。原來有人在教皇烏爾邦八世麵前挑撥說伽利略在《對話》中，借頭腦簡單、思想守舊的辛普利邱之口以教皇慣用辭句，發表了一些可笑的錯誤言論，使他大為震怒。曾支持他當上教皇的集團激烈地主張要嚴懲伽利略，而神聖羅馬帝國和西班牙王國認為如縱容伽利略會對各國國內的異端思想產生重大影響，提出聯合警告。在這些內外壓力和挑撥下，教皇便不顧舊交，於這年秋發出了伽利略到羅馬宗教裁判所受審的指令。
年近七旬而又體弱多病的伽利略被迫在寒冬季節抱病前往羅馬，在嚴刑威脅下被審訊了三次，根本不容申辯。幾經折磨，終於在1633年6月22日在聖瑪麗亞修女院的大廳上由10名樞機主教聯席宣判，主要罪名是違背“1616年禁令”和聖經教義。伽利略被迫跪在冰冷的石板地上，在教廷已寫好的“悔過書”上簽字。主審官宣布：判處伽利略終身監禁；《對話》必須焚絕，並且禁止出版或重印他的其他著作。此判決書立即通報整個天主教世界，凡是設有大學的城市均須聚眾宣讀，借此以一儆百。
伽利略既是勤奮的科學家,又是虔誠的天主教徒,深信科學家的任務是探索自然規律，而教會的職能是管理人們的靈魂，不應互相侵犯。所以他受審之前不想逃脫，受審之時也不公開反抗，而是始終服從教廷的處置。他認為教廷在神學範圍之外行使權力極不明智，但隻能私下有所不滿。顯然，G.布魯諾的被處火刑和T.康帕內拉的被長期打入死牢，這兩位意大利傑出的哲學家的遭遇，給他精神上投下了可怕的陰影。宗教裁判所的判決隨後又改為在家軟禁，指定由他的學生和故友A.皮柯羅米尼大主教在錫耶納的私宅中看管他，規定禁止會客，每天書寫材料均需上繳等。在皮柯羅米尼的精心護理和鼓勵下,伽利略重行振作起來,接受皮柯羅米尼的建議繼續研究無爭議的物理學問題。於是他仍用《對話》中的三個對話人物，以對話體裁，和較樸素的文筆，將他最成熟的科學思想和科研成果撰寫成《關於兩門新科學的對話與數學證明對話集》。兩門新科學是指材料力學（見彈性力學）和動力學。這部書稿1636年就已完成,由於教會禁止出版他的任何著作,他隻好托一位威尼斯友人秘密攜出國境，1638年在荷蘭萊頓出版。
伽利略在皮柯羅米尼家中剛過了5個月,便有人寫匿名信向教廷控告皮柯羅米尼厚待伽利略。教廷乃勒令伽利略於當年12月遷往佛羅倫薩附近的阿切特裏他自已的故居，由他的大女兒維姬尼亞照料，禁例依舊。她對父親照料體貼，但4個月後竟先於父親病故。
伽利略多次要求外出治病，均未獲準。1637年雙目失明。次年才獲準住在其子家中。在這期間探望他的除托斯卡納大公外，還有英國著名詩人、政論家J.彌爾頓和法國科學家、哲學家P.伽桑迪。他的學生和老友B.卡斯泰裏還和他討論過利用木衛星計算地麵經度的問題。這時教廷對他的限製和監視已明顯放鬆了。
1639年夏，伽利略獲準接受聰慧好學的18歲青年V.維維亞尼為他的最後一名學生，並可在他身邊照料，這位青年使他非常滿意。1641年10月卡斯泰裏又介紹自己的學生和過去的秘書托裏拆利前往陪伴。他們和這位雙目失明的老科學家共同討論如何應用擺的等時性設計機械鍾，還討論過碰撞理論、月球的天平動、大氣壓下礦井水柱高度等問題，因此，直到臨終前他仍在從事科學研究。
伽利略於1642年1月8日病逝，葬儀草率簡陋，直到下一世紀，遺骨才遷到家鄉的大教堂。