1587年他帶著關於固體重心計算法的論文到羅馬大學學求見著名數學家和曆法家C.克拉維烏斯教授，大受稱讚和鼓勵。克拉維烏斯回贈他羅馬大學教授P.瓦拉的邏輯學講義與自然哲學講義，這對於他以後的工作大有幫助。
1588年他在佛羅倫薩研究院做了關於A.但丁《神曲》中煉獄圖形構想的學術演講，其文學與數學才華大受人們讚揚。次年發表了關於幾種固體重心計算法的論文，其中包括若幹靜力學新定理。由於有這些成就，當年比薩大學便聘請他任教，講授幾何學與天文學。第二年他發現了擺線。當時比薩大學教材均為亞裏士多德學派的學者所撰，書中充斥著神學與形而上學的教條。伽利略經常發表辛辣的反對意見,由此受到校內該學派的歧視和排擠。1591年其父病逝，家庭負擔加重，他便決定離開比薩。帕多瓦時期1592年伽利略轉到帕多瓦大學任教。帕多瓦屬於威尼斯公國，遠離羅馬，不受教廷直接控製，學術思想比較自由。在此良好氣氛中，他經常參加校內外各種學術文化活動，與具有各種思想觀點的同事論辯。此時他一麵吸取前輩如N.F.塔爾塔利亞、G.B.貝內代蒂、F.科門迪諾等人的數學與力學研究成果，一麵經常考察工廠、作坊、礦井和各項軍用民用工程，廣泛結交各行業的技術員工，幫他們解決技術難題，從中吸取生產技術知識和各種新經驗，並得到啟發。
在此時期，他深入而係統地研究了落體運動、拋射體運動、靜力學、水力學以及一些土木建築和軍事建築等；發現了慣性原理，研製了溫度計和望遠鏡。
1597年，他收到J.開普勒贈閱的《神秘的宇宙》一書，開始相信日心說，承認地球有公轉和自轉兩種運動。但這時他對柏拉圖的圓運動最自然最完善的思想印象太深，以致對開普勒的行星橢圓軌道理論不感興趣。1604年天空出現超新星，亮光持續18個月之久。他便趁機在威尼斯作幾次科普演講，宣傳哥白尼學說。由於講得精采動聽，聽眾逐次增多，最後達千餘人。
1609年7月,盛傳一荷蘭眼鏡工人發明了供人玩賞的望遠鏡。他未見到實物，思考竟日後，用風琴管和凸凹透鏡各一片製成一具望遠鏡,倍率為3,後又提高到9。他邀請威尼斯參議員到塔樓頂層用望遠鏡觀看遠景，觀者無不驚喜萬分。參議院隨後決定他為帕多瓦大學的終身教授。1610年初，他又將望遠鏡放大率提高到33，用來觀察日月星辰，新發現甚多，如月球表麵高低不平，月球與其他行星所發的光都是太陽的反射光,水星有4顆衛星，銀河原是無數發光體的總彙，土星有多變的橢圓外形等等，開辟了天文學的新天地。是年3月,出版了他的《星空信使》一書，震撼全歐。隨後又發現金星盈虧與大小變化，這對日心說是一強有力的支持。伽利略日後回顧在帕多瓦的18年時，認為這是他一生中工作最開展、精神最舒暢的時期。事實上，這也是他一生中學術成就最多的時期。
托斯卡納時期20年來伽利略在物理學和天文學研究上的豐碩成果，激起了他學術上的更大企求。為了取得充裕時間致力於科學研究，1610年春，他辭去大學教職，接受托斯卡納公國大公聘請，擔任宮廷首席數學家和哲學家的閑職與比薩大學首席數學教授的榮譽職位。
為了使科學免受教會幹預，伽利略曾多次去羅馬活動。1611年他第二次去羅馬，目的在於贏得宗教、政治與學術界認可他在天文學上的發現。他在羅馬受到包括教皇保羅五世和若幹高級主教在內的上層人物的熱情接待，並被林賽研究院接納為院士。當時耶穌會的神父們承認他的觀測事實，隻是不同意他的解釋。這年5月,在羅馬大學的大會上，幾個高職位的神父公開宣布了伽利略的天文學成就。
同年，他觀察到太陽黑子及其運動，對比黑子的運動規律和圓運動的投影原理，論證了太陽黑子是在太陽表麵上;他還發現了太陽有自轉。1613年他發表了3篇討論太陽黑子問題的通信稿。另外,1612年他又出版了《水中浮體對話集》一書。
1615年，一詭詐的教士集團和教會中許多與伽利略敵對的人聯合攻擊伽利略為哥白尼學說辯護的論點，控告他違反基督教義。他聞訊後，於是年冬第三次去羅馬，力圖挽回自己的聲譽，企求教廷不因自己保持哥白尼觀點而受到懲處，也不公開壓製他宣傳哥白尼學說，教廷默認了前一要求，但拒絕了後者。教皇保羅五世在1616年下達了著名的“1616年禁令”，禁止他以口頭的或文字的形式保持、傳授或捍衛日心說。
1624年，他第四次去羅馬，希望故友新任教皇烏爾邦八世能夠同情並理解他的意願，以維護新興科學的生機。他先後謁見6次,力圖說明日心說可以與基督教教義相協調，說“聖經是教人如何進天國，而不是教人知道天體是如何運轉的”;並且試圖以此說服一些大主教,但毫無效果。烏爾邦八世堅持“1616年禁令”不變；隻允許他寫一部同時介紹日心說和地心說的書，但對兩種學說的態度不得有所偏倚，而且都要寫成數學假設性的。在這辛勤奔波的一年裏，他研製成了一台顯微鏡，“可將蒼蠅放大成母雞一般。”